醫(yī)學細胞生物學實驗指導及復習思考題 節(jié)選

**部分 醫(yī)學細胞生物學實驗 實驗一 普通光學顯微鏡的結構和使用 【實驗目的】 (1)了解普通光學顯微鏡的構造及成像原理。 (2)掌握低倍鏡、高倍鏡的正確使用方法。 【實驗原理】 普通光學顯微鏡主要由物鏡和目鏡組成，均為凸透鏡。物鏡的焦距（f1）短，目鏡的焦距（f2）長。物鏡到標本(BA)的距離稍大于物鏡(Lo)的焦距，標本經(jīng)物鏡放大后，形成放大倒立的實像A'B'，實像A'B是目鏡的物體，它位于目鏡的焦點以內，所以A'B'經(jīng)目鏡(Le)再次放大后，形成放大的虛像A"B"（圖1-1）。 【實驗物品】 圖1-1 普通光學顯微鏡成像原理圖 1.材料與標本字片、紅綠羊毛交叉片、人血涂片。 2.器材顯微鏡、擦鏡紙。 3.試劑香柏油、二甲苯（或乙醚-乙醇混合液，比例為2：3）。 圖1-2 普通光學顯微鏡 【實驗步驟】 （一）顯微鏡的結構 普通光學顯微鏡由機械部分、照明部分和光學部分組成（圖1-2）。 1.機械部分顯微鏡的機械部分包括鏡座、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、推動器、粗調手輪、微調手輪等部件。 (1)鏡座：鏡座是顯微鏡的基本支架，它由底座和鏡臂兩部分組成。在它上面連接有載物臺和鏡筒，它是用來安裝光學放大系統(tǒng)部件的基礎。底座和鏡臂起稔定和支撐整個顯微鏡的作用。 (2)鏡筒：鏡筒上接接目鏡，下接轉換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉換器下）間的暗室。從物鏡的后緣到鏡筒尾端的距離稱為機械筒長。因為物鏡的放大率是對一定的鏡筒長度而言的。鏡筒長度的變化，不僅放大倍率隨之變化，而且成像質量也受到影響。因此，使用顯微鏡時，不能任意改變鏡筒長度。國際上將顯微鏡的標準筒長定為160 mm，此數(shù)字通常標在物鏡的外殼上。鏡筒有單筒式、雙筒式兩種，單筒式鏡筒又分直立和傾斜式，而雙筒式鏡筒均為傾斜式。 (3)物鏡轉換器：物鏡轉換器上可安裝3～4個接物鏡，一般是3個接物鏡（低倍、高倍、油鏡）。轉動轉換器，可以按需要將其中的任何一個接物鏡和鏡筒接通，與鏡筒上面的接目鏡構成一個放大系統(tǒng)。 (4)載物臺：載物臺中央有一孔，為光線通路。在臺上裝有彈簧標本夾和推動器，其作用為固定或移動標本的位置，使得鏡檢對象恰好位于視野中心。 (5)推動器：是移動標本的機械裝置，它是由一橫一縱兩個推進齒軸的金屬架構成的，好的顯微鏡在縱橫架桿上刻有刻度標尺，構成很精密的平面坐標系。如果我們須重復觀察已檢查標本的某一部分，在**次檢查時，可記下縱橫標尺的數(shù)值，以后按數(shù)值移動推動器，就可以找到原來標本的位置。 (6)粗調手輪（粗螺旋）：粗調手輪是移動鏡筒調節(jié)接物鏡和標本間距離的機件，老式顯微鏡粗調手輪向前扭，鏡頭下降接近標本。新近出產(chǎn)的顯微鏡鏡檢時，右手向前扭載物臺上升，讓標本接近物鏡，反之則下降，標本脫離物鏡。 (7)微調手輪（細螺旋）：用粗調手輪只可以粗放的調節(jié)焦距，要得到*清晰的物像，需要用微動螺旋做進一步調節(jié)。微調手輪每轉一圈鏡筒移動0.1mm（100μm）。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡的粗調手輪和微調手輪是共軸的。 2.照明部分安裝在載物臺的下方，由反光鏡（光源）、聚光器和光圈組成。 (1)反光鏡：較早的普通光學顯微鏡是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成，可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡的中央，照明標本。不用聚光器時用凹面鏡，凹面鏡能起會聚光線的作用。用聚光器時，一般都用平面鏡。電光源普通光學顯微鏡沒有反光鏡，而在顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調節(jié)螺旋，可通過調節(jié)電流大小調節(jié)光照強度。 (2)聚光器：聚光器在載物臺下面，它是由一組聚光透鏡和升降螺旋組成的。聚光器安裝在載物臺下，其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上，以得到*強的照明，使物像獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以調節(jié)，使焦點落在被檢物體上，以得到*大亮度。一般聚光器的焦點在其上方1.25 mm處，而其上升限度為載物臺平面下方0.1 mm。因此，要求使用的載玻片厚度應在0.8～1.2 mm，否則被檢樣品不在焦點上，影響鏡檢效果。 (3)光圈：聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開大和縮小，控制通過的光量，從而影響著成像的分辨力和反差，若將虹彩光圈開放過大，超過物鏡的數(shù)值孔徑時，便產(chǎn)生光斑；若收縮虹彩光圈過小，分辨力下降，反差增大。因此，在觀察時，通過虹彩光圈的調節(jié)再把視場光闌（帶有視場光闌的顯微鏡）開啟到視場周緣的外切處，使不在視場內的物體得不到任何光線的照明，以避免散射光的干擾。 3.光學部分 (1)目鏡：安裝在鏡筒上端，為雙筒目鏡，通常用10×的目鏡。 (2)物鏡：安裝在鏡筒前端轉換器上的接物透鏡利用光線使被檢物體**次造像，物鏡成像的質量，對分辨力有著決定性的影響。一般有3～4個物鏡（圖1-3），通常在物鏡上標有主要性能指標——放大倍數(shù)和鏡口率，如1010.25、40/0.65和100／1.30。 圖1-3 普通光學顯微鏡物鏡鏡頭 物鏡的種類很多，可從不同角度來分類：根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質不同，可分為：①干燥系物鏡：以空氣為介質，如常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。②油浸系物鏡：常以香柏油為介質，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×～100×，數(shù)值孔值大于1。 數(shù)值孔徑(numerical aperture，N.A.)，也叫做鏡口率（或開口率）。在物鏡和聚光器上都標有它們的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判斷它們性能的*重要指標。物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。數(shù)值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關系，它反映該物鏡分辨力的大小，數(shù)值越大，其分辨力越高。分辨力是指顯微鏡能夠分辨物體上的*小間隔的能力，這個可分辨的*小間隔距離越近，分辨力越高。人的分辨力可達0.1mm，顯微鏡的分辨力能達到0.2μm。 R為分辨力，λ為光波波長，N.A.為鏡口率，卵為介質折射率，α為透鏡錐頂角，折射率大的介質（如香柏油的折射率為1.515，空氣的折射率為1），其分辨力也大。 工作距離指物像調節(jié)清楚時物鏡下表面與蓋玻片上表面之間的距離；物鏡的放大倍數(shù)越大，工作距離越小。 （二）普通光學顯微鏡的使用方法 1.低倍鏡(10×)的使用 (1)將顯微鏡放在離實驗臺邊緣10 cm處（至少約一拳的距離）。 (2)打開顯微鏡的電源開關，然后使低倍鏡對準鏡臺，開大光圈，上升聚光器并調節(jié)光亮調節(jié)旋鈕至視野內光線明亮度適中。 (3)放置標本片：取一張載有標本的載玻片（以下簡稱玻片標本），先用肉眼觀察，以確定正反面（載有標本的面為正面，一般都貼有標簽）和標本的大致位置。再將玻片標本正面朝上放置在載物臺并用彈簧夾夾好，用推進器將玻片標本的標本移到載物臺網(wǎng)孔，聚光鏡的正方。 (4)調節(jié)焦距：從顯微鏡側面注視物鏡鏡頭，同時轉動粗調手輪，使得載物臺上升到*高（物鏡頭與標本片的距離約5mm處），然后一邊在目鏡上觀察，一邊緩慢轉動粗調手輪，使載物臺緩慢下降至視野中出現(xiàn)清晰的物像。 如經(jīng)過上述步驟還無法看清楚圖像，應報告帶教老師求得幫助，也可以重復操作一次。 2.高倍鏡(40×)的使用 (1)選好目標：一定先在低倍鏡下把待觀察部位移動到視野中心，將物像調節(jié)清晰。 (2)轉換高倍鏡物鏡：為防止鏡頭碰撞玻片，從顯微鏡側面注視著，慢慢地轉動轉換器使高倍鏡頭對準通光孔。 (3)調節(jié)焦距：觀察目鏡同時稍稍調節(jié)細調手輪，即可獲得清晰的物像。若視野亮度不夠，可上升聚光器和開大光圈。 3.油鏡(100×)的使用 (1)選好目標：在高倍鏡下確定玻片標本上要用油鏡觀察的部位并移至視野的正中央。 (2)轉換油鏡：轉動轉換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在載物臺網(wǎng)孔上方的玻片標本處滴一滴香柏油。然后從側面注視著鏡頭與玻片，慢慢轉換油鏡使鏡頭浸入油中。 (3)調節(jié)光亮：將聚光器升到*高位置，光圈開到*大。 (4)調焦：觀察目鏡同時調節(jié)細調手輪，使得物像清晰。 若目標不理想或不出現(xiàn)物像需重找，在加油區(qū)之外重找應按：低倍-高倍油鏡程序。在加油區(qū)內重找應按：低倍-油鏡程序，以免油沾污高倍鏡頭。 (5)擦拭油鏡頭：觀察完畢，先用干的擦鏡紙吸掉粘在油鏡頭上的油，再用擦鏡紙條沾少許二甲苯（或乙醚-乙醇混合液，比例為2：3）擦拭鏡頭及周圍，*后用干的擦鏡紙擦干多余的二甲苯。 (6)玻片標本上的油處理方法同上，只是因為玻片上的油較多，要重復2～3次才能擦干凈。 【實驗結果和詛錄】 1.低倍鏡的練習比較肉眼直接觀察字片與低倍鏡下觀察物像的有什么區(qū)別？左右前后移動玻片與低倍鏡下觀察到的物像有什么區(qū)別？ 2.高倍鏡的練習取紅綠羊毛交叉片，先在低倍鏡下找到羊毛，并將紅綠羊毛的交叉點移到視野的中心，再換高倍鏡觀察，能否在交叉點同時看到兩根羊毛（利用細螺旋進行判斷）。 3.油鏡的練習取人血涂片，先用低倍鏡、高倍鏡觀察，再換油鏡觀察。比較三種放大 倍數(shù)的物鏡的分辨力并練習擦拭油鏡頭和標本片。 【注意事項】 (1)顯微鏡的光學部分不能用手直接摸擦。 (2)不可隨意拆卸顯微鏡的零部件。 (3)需要更換標本片時，將物鏡頭轉離載物臺，方可取下或放置標本片。 (4)轉換物鏡時應轉動物鏡上方的旋轉器，切忌手持物鏡轉換。 (5)要是長時間不用顯微鏡時，請將顯微鏡電光源的亮度調到*暗（維持燈的壽命）。 (6)顯微鏡使用完畢后，必須復原，其具體步驟是：先轉動轉換器使物鏡頭離開通光孔，再取下標本片，下降載物臺，下降聚光器、關閉光圈，玻片移動器回位，將顯微鏡電光源的亮度調到*暗，再關閉電源，蓋上綢布和外罩，*后將顯微鏡放在桌子的中央。（柯志勇） 實驗二 細胞基本形態(tài)和結構 【實驗目的】 (1)熟悉人體及動植物細胞的基本形態(tài)和結構。 (2)初步掌握臨時玻片標本的制備方法。 (3)初步學習搗毀脊髓法處死青蛙或蟾蜍的操作方法。 (4)初步掌握光學顯微鏡下所見細胞、組織結構的繪圖記錄方法。 (5)進一步掌握光學顯微鏡的規(guī)范使用方法。 【實驗原理】 細胞是生命活動的基本結構單位和功能單位。構成人體和其他高等動植物的細胞種類繁多，形態(tài)各異。有球形、橢圓形、扁平形、立方形、長梭形、星形等。細胞的形態(tài)結構與功能相關是很多細胞的共同特點，在分化程度較高的細胞更為明顯，這種合理性是生物漫長進化過程所形成的。例如：具有收縮功能的肌細胞呈長梭形或條形；具有感受刺激和傳導沖動機能的神經(jīng)細胞有長短不一的樹枝狀突起；游離的血細胞為圓形、橢圓形或網(wǎng)餅形。 高等生物體不同細胞的大小差異很大，其直徑大多數(shù)在10～100 μm，一般都需要借助顯微鏡才能看到。由于細胞較小，而且其內含有較大比例的水分，故大多是無色透明的，如果不經(jīng)染色處理，在顯微鏡下難以看清細胞的結構。因此，要觀察某種細胞時，通常先進行染色處理。 雖然細胞的形態(tài)、大小和功能各不相同，但在普通光學顯微鏡下，一般可見人體及動物細胞的基本結構可分為細胞膜(cell membrane)、細胞質(cytoplasm)和細胞核(nucleus)三個部分。但也有例外。例如：哺乳類紅細胞成熟時細胞核消失。植物細胞的基本結構可分為細胞壁( cell wall)、細胞膜、細胞質和細胞核四個部分。 【實驗物品】 1.材料和標本青蛙或蟾蜍、洋蔥、人口